Trinitatis Kirke er et af Christian den 4.s mest kendte bygninger. Han ønskede at bygge en universitetskirke for universitets professorer og studerende. Bygningen skulle både være kirke og kunne have verdslige funktioner. Udover kirkerummet skulle den rumme den kongelige bogsamling og et observatorium. Denne tredeling er afspejlet i kirkens navn - Trinitatis Kirke - Treenigheden, hvor Faderen er i Himmelen, Sønnen er sandheden (i bøgerne) og Helligånden er i Kirken.
Efter at grundene på hjørnet af Købmagergade og Landemærket var blevet ryddet for huse blev grundstenen lagt den 7. juli 1637. Rundetaarn stod færdig 1642-43 og den sidste sten i hvælvingerne blev sat 7. juli 1651 og kirken blev indviet Trinitatis søndag 1. juni 1656.

Vi ved, at Christian den 4. selv havde været i planlægningen af byggeriet. Det praktiske arbejde ved byggeriet stod de kongelige bygmestre for. Bygningens udseende var planlagt i meget grove træk og en række ikke uvæsentlige detaljer fandt først deres endelige udformning under byggeriet. F.eks. blev Rundetaarns højde først bestemt mens byggeriet stod på.
Kirken ligner ikke nogen af Christian den 4.'s andre bygninger. Mens de er bygget i hollandsk renæssancestil peger Trinitatis Kirkes arkitektur bagud. Der er romanske elementer i Rundetårns frise øverste på tårnet, gotiske træk i de spidsbuede kirkevinduer og i hvælvene i kirkerummet. Kirkerummets pillers baser og kapitæler er inspireret af den italienske renæssance. Kirkerummet er ca. 50 meter langt, 20 meter bredt og 18 meter højt. Det er et stort rum for en menighed der kun skulle bestå af universitets folk. Noget tyder på at kirkerummets størrelse blev bestemt af bibliotekets behov for gulvplads.
Trinitatis Kirke blev opført som universitetskirke og patronatet blev givet til Universitetet, men der fulgte igen indtægter med en sådan ordning. Så kirken måtte klare sig ved salg af stolestader og begravelser – en noget usikker finansieringsmetode. I 1686 blev kirken derfor ved Kongelig Resolution tildelt et sogn, der gav mulighed for faste indtægter. Denne ordning svækkede tilknytningen til Universitetet.

Som alle historiske bygninger i København er Trinitatis Kirkes historie tæt sammenvævet med byens. Under den store brand i 1728 udbrændte kirken. Det var kun det mest hårdføre inventar, gravgittrene, Schacks epitafium og kirkesølvet, der overlevede. Selvom Trinitatis Kirke var hårdt ramt, stod murene og de fleste hvælvinger endnu. Så genopbygningen gik hurtigt og kirken blev genindviet den 7. oktober 1731. Kirkens inventar blev helt fornyet, og det er i store træk det nuværende. Barokinventaret blev lavet af træskæreren Fr. Ehbisch og stenhuggeren Didrich Gerchen. Et nyt islet i Trinitatis Kirke efter branden var pulpiturene. De blev opført som loger og i sydsiden var logerne i to etager. Det gav kirkerummet audiotoriepræg, hvor prædikestolen var centrum. Det stemmer overens med tidens teologi, hvor det var ordet der var i centrum for troen.

Under englændernes bombardement i september 1807 blev kirken ramt flere gange, men kirkeværgen og hans hjælpere fik hver gang slukket ilden. På universitetsbiblioteket opbevares i dag en bog der blev ramt. Bogens titel er ironisk nok - Defensor Pacis - Fredens forsvarer. Selv om Trinitatis Kirke slap uskadt fik denne begivenhed stor betydning for kirkens udseende. Bombardementet ødelagde Frue Kirke og med Vor Frue ødelagt blev det Trinitatis Kirke, der kom til at lægge hus til reformationsjubilæet i 1817. For at få plads til Det kongelige Kapel samt sangere fra operaen fik C.E.F. Weyse, der havde komponeret en jubilæumskantate, opført et højt pulpitur ved alteret. Kirkens hovedindgang var oprindeligt den sydlige dør. For at komme ind af den måtte man henover den gamle kirkegård. Denne indgang blev ikke fundet pæn nok til at modtage de fine gæster i forbindelse med jubilæet. Derfor blev de små boder der lå opad kirken i Landemærket fjernet og der blev lavet en standsmæssig indgang på nordsiden. I 1834-5 blev der opført to skriftestole under musiktribunen. En følge af dette byggeri var, at de gamle smedejernsgittre ned til Friisernes og Körbitzernes gravkrypter måtte flyttes op til deres nuværende plads i koret. I 1869 blev Trinitatis Kirke endeligt løst fra universitetets patronat mod at universitetet betalte en del af en større udvendig istandsættelse. Indgangsportalerne blev flyttet et fag højere op og de gamle firkantede vinduer i bibliotekssalen blev udskiftet med de nuværende, der skal ligne Rundetårns. Den sidste store restaurering fandt sted i 1981-2. Ved den blev kirkens udseende i vid udstrækning ført tilbage til udseendet efter 1731. Pulpiturene fik deres oprindelige lyse farve tilbage og hvælvingernes guld blev fremdraget igen.